Popularni Postovi

Izbor Urednika - 2019

PCR (lančana reakcija polimeraze)

Ne tako davno, razvijena je pouzdana, visoko osetljiva i brza metoda za dijagnosticiranje raznih zaraznih bolesti ljudi. Ova metoda se naziva "PCR analiza". Šta je to, kakva je njegova suština, šta mikroorganizmi mogu da otkriju i kako da to ispravno uradimo, reći ćemo u našem članku.

Istorija otkrića

Američki naučnik Carey Mullis 1983. godine izumio je metodu lančane reakcije polimeraze (PCR), a metoda dijagnostike korporacije Cetus, u kojoj je njen tvorac radio, izvorno je patentirana. Ali 1992. godine sva prava i patenti su prodati Hoffman-La Roche-u. Nakon toga, ispostavilo se da su paralelne slične studije provedene i da su ih zabilježili drugi američki biolozi, kao što su Alice Chan, David Edgar i John Trell. 1980. godine sovjetski naučnici A. Slyusarenko, A. Kaledin i S. Gorodetski su se također bavili ovim problemom. Prema tome, nije bilo moguće utvrditi nosioca pojedinačnih prava. Mnogi eminentni biohemičari su nedvosmisleno dali doprinos razvoju PCR metodologije i patentirali su svoje inovacije. Trenutno se PCR analiza provodi svuda u posebno opremljenim laboratorijama.

Zašto PCR dijagnostika ima takvu vrijednost?


Jedna od značajnih prednosti PCR metode je visoka osjetljivost - od 95 do 100%. Međutim, ove beneficije treba da se zasnivaju na neophodnom poštovanju sledećih uslova:

  1. ispravno sakupljanje, transport biološkog materijala,
  2. dostupnost sterilnih, jednokratnih instrumenata, specijalnih laboratorija i obučenog osoblja,
  3. strogo pridržavanje metoda i sterilnosti tokom analize
Osetljivost je različita za različite detektabilne mikrobe. Na primjer, osjetljivost PCR metode za otkrivanje virusa hepatitisa C je 97-98%, osjetljivost za detekciju ureaplazme je 99-100%.

Mogućnosti inherentne PCR analizi, omogućavaju nam da postignemo nenadmašnu analitičku specifičnost. To znači identifikaciju mikroorganizma koji ste tražili, a koji nije sličan ili usko povezan.
Dijagnostička osjetljivost i specifičnost PCR metode često su bolji od onih za kulturnu metodu, nazvanu „zlatni standard“ za otkrivanje zaraznih bolesti. S obzirom na dužinu uzgoja kulture (od nekoliko dana do nekoliko sedmica), prednost PCR metode postaje očigledna.

PCR u dijagnostici infekcija
Prednosti PCR metode (osjetljivost i specifičnost) određuju širok spektar primjena u modernoj medicini.
Glavne primjene PCR dijagnostike:

  1. dijagnostika akutnih i hroničnih zaraznih bolesti različite lokalizacije
  2. praćenje efikasnosti terapije
  3. specifikacija vrste patogena
PCR se koristi u akušerstvu, ginekologiji, neonatologiji, pedijatriji, urologiji, venerologiji, nefrologiji, klinici za infektivne bolesti, oftalmologiji, neurologiji, ftiopsolmonologiji itd.

Primjena PCR dijagnostike provodi se zajedno s drugim metodama istraživanja (ELISA, PIF, REEF, itd.). Njihovu kombinaciju i svrsishodnost određuje lekar.

Infektivni patogeni otkriveni PCR-om

Virusi:

  1. retrovirusa HIV-1 i HIV-2
  2. herpetiform virusi
  3. herpes simplex virus tip 1 i 2
  4. citomegalovirus
  5. Epstein-Barr virus
  6. varicella - zoster virus
  7. herpes humanih virusa 6 i 7
  8. hepatitis C, B i A
  9. humani papiloma virus
  10. virus rubeole
  11. adenovirusi
  12. rinovirusi
  13. parvoviruses
  14. picornoviruses

Bakterije:
  1. mycobacterium
  2. klamidija
  3. mycoplasma
  4. salmonella
  5. legionella
  6. Clostridiums
  7. pale treponema
  8. različite patogene vrste E. coli
  9. Vibrio cholerae
  10. rickettsia
  11. Staphylococcus aureus
  12. bakterijski uzročnik meningitisa
  13. Helicobacter pylori
  14. ureaplasma
  15. uzročnik gonoreje
  16. štap za difteriju
  17. hemofilni bacil

Ova lista sadrži najčešće infektivne agense otkrivene PCR-om. U stvari, ova lista je mnogo šira, stalno se ažurira, pošto se sintetišu nova “semena”. Takođe treba napomenuti da je lista identifikovanih patogena određena prisustvom “prajmera” za identifikaciju u arsenalu svake specifične laboratorije.

U čemu je suština lančane reakcije polimeraze?

PCR istraživanje je postignuće i veliko dostignuće molekularne biologije. To je metoda koja, otkrivanjem mikrosita DNK ili RNK stranog genetskog materijala (genoma), može prepoznati pojedinačne karakteristike svojstvene samo jednoj vrsti mikroorganizma, a da je ne zbunjuje sa bilo kojim drugim. Kako funkcionira PCR metoda i kako uspijeva vratiti sliku ponašanja zarazne stanice u živom organizmu?

PCR proces

Dakle, pronađen je fragment nukleinske kiseline, ali on je sam i nije dovoljan za provođenje reakcije, stoga je kodiran (kopiranje). Međutim, za dalji proces je potreban veliki broj takvih mikropocica, koje mogu osigurati njegovu reprodukciju kompletiranjem novih DNK segmenta identičnih pronađenom fragmentu (replikacija). Reprodukcija je prirodna i inherentna osobina nukleinske kiseline koja će se ponoviti upotrebom enzim polimeraze čak i izvan živog organizma (u epruveti sa uzorkom), formirajući mnoge klonove, to jest, ići će lančana reakcija. Klonirat će se svi novi i novi fragmenti, ali samo oni u kojima je istraživač zainteresiran. Zato je tako Važno je uzeti “čistu” analizu, bez ikakvih nečistoća, i provesti test vrlo pažljivo.

Imajući u vidu navedene sposobnosti lančane reakcije polimeraze, možete pogoditi zašto ona tako lako razlikuje ureaplazmu od mikoplazme, ili svaku od njih od hlamidije.

Tako, čak i ako se među milionima ćelija ljudskog tela, a ne samim virusom, izgubi, ali samo deo njegove DNK, onda PCR, ako ga ništa ne sprečava, verovatno će se nositi sa zadatkom i prijaviti prisustvo „vanzemaljaca“ sa pozitivnim rezultatom. To je suština PCR-a i njegove glavne prednosti.

Snage i slabosti

Laboratorija koja obavlja PCR dijagnostiku ima najviše zahtjeve u pogledu opreme, ispitnih sustava i kvalifikacija medicinskog osoblja. To je visokotehnološki laboratorij sa arsenalom visoko osetljivih i visoko specifičnih reagensa, tako da nema nikakvih specifičnih nedostataka. Da li to daje pozitivan rezultat u odsustvu kliničkih manifestacija, i tako postavlja kliniku pre dileme: treba li početi sa lečenjem ili ne?

Lekar, posmatrajući pacijenta, počinje da sumnja u pouzdanost rezultata ispitivanja, jer ne vidi nikakve znakove bolesti. Ali ipak Imajući u vidu visoku osetljivost PCR sistema, treba imati na umu da detektira patogen čak iu predkliničkoj fazi, a pozitivan rezultat u ovom slučaju više je nego prednost. Na osnovu toga, lekar mora odlučiti o prikladnosti terapije, uzimajući u obzir druge prednosti i nedostatke.

Prednosti dijagnostike polimeraznom lančanom reakcijom su očigledne:

  • Visoka specifičnostdostižući 100%, zbog prisutnosti u uzorku čestica nukleinskih kiselina svojstvenih određenom organizmu, ali stranom čovjeku,
  • Visoke performansezato što je PCR visokotehnološka automatizovana tehnika koja obezbeđuje sposobnost da se provede testiranje na dan uzimanja materijala i oslobađanje pacijenta od nepotrebnih poremećaja,
  • PCR, koji radi na jednom uzorku, je u stanju da sprovede nekoliko studija i okodetektovati nekoliko patogena, ako će ona biti takav zadatak. Na primer, u dijagnostici hlamidijske infekcije, gde je PCR jedna od glavnih metoda, zajedno sa hlamidijom, moguće je detektovati neisseria (gonokok), uzročnika gonoreje. Štaviše, pouzdanost rezultata nije negativno pogođena,
  • PCR testiranjepokazuje opasne mikroorganizme u periodu inkubacijekada nisu imali vremena da nanose značajna oštećenja organizmu, tj. rana dijagnoza upozorava na predstojeći razvoj patološkog procesa, koji omogućava da se za njega pripremi i uzme u potpunosti naoružanje.

Pored toga, da bi se izbegli nesporazumi, koji se ponekad javljaju tokom dijagnoze, PCR se štiti činjenicom da se njegovi rezultati mogu fiksirati (foto, računar) u svrhu njihove upotrebe u stručne svrhe, ako je potrebno.

Negativan odgovor se smatra normalnim u PCR odgovorima., ukazujući na odsustvo fragmenata stranih nukleinskih kiselina, pozitivan odgovor će ukazati na prisutnost infekcije u tijelu, digitalne vrijednosti ukazuju na stanje virusa i njegovu koncentraciju u vrijeme testiranja. Međutim, potpuno dešifriranje analize vrši lekar koji je prošao posebnu studiju na temu PCR. Pokušaj samostalnog tumačenja rezultata nema nikakvog smisla, jer je moguće, kao što je verovatno da se desi, pogrešno shvatiti i početi brinuti unaprijed.

Šta se PCR „boji“, šta je u stanju učiniti i kako se pripremiti za to?

Kao iu svim drugim studijama, ponekad rezultati testa ispadnu lažno pozitivni ili lažno negativnigdje PCR nije izuzetak. To se može dogoditi u sljedećim slučajevima:

  1. Kršenja procesa u jednoj fazi reakcije,
  2. Nepoštovanje pravila za sakupljanje materijala, njegovo skladištenje ili transport,
  3. Prisustvo nečistoća u materijalu.

Ovo sugeriše da se PCR - dijagnostika infekcija mora pristupiti pažljivo, pažljivo i pažljivo, inače uzorci materijala mogu da promene strukturnu strukturu ili čak kolaps.

Faze PCR dijagnostike. Lažni rezultati mogu izazvati nepravilnosti u bilo kojoj fazi istraživanja.

PCR dijagnostika infekcija spada u kategoriju "zlatnih standarda" među ostalim laboratorijskim metodama, tako da se može koristiti za traženje uzročnika mnogih bolesti koje na prvi pogled nemaju ništa zajedničko:

  • Tuberkuloza različite lokalizacije, upale pluća (uključujući atipične, uzrokovane klamidijom),
  • Infekcije kod djece (ospice rubeole, parotitis, ospice),
  • Difterija,
  • Salmonellosis,
  • Zoonotska infektivna bolest - listerioza (bolest se odlikuje raznim simptomima sa oštećenjem limfnih čvorova, centralnog nervnog sistema, unutrašnjih organa),
  • Bolesti uzrokovane prodiranjem Epstein-Barr virusa (infektivna mononukleoza, itd.),
  • Patologija raka izazvana HPV infekcijom (HPV i njeni tipovi),
  • Borrelioza (lajmska bolest, krpeljni encefalitis),
  • Helicobacter pylori infekcija, koja je uzrokovana humanim mikrobom Helicobacter pylori koji živi u ljudskom stomaku. Dokazano je da Helicobacter uzrokuje rak želuca ili duodenuma 12,
  • Kandidijaza i praktično sve spolno prenosive bolesti.

PCR dijagnostika polno prenosivih infekcija je od posebnog značaja, jer tako izazvane bolesti često traju dugo bez ikakvih kliničkih manifestacija, ali onda postaju aktivnije tokom trudnoće i time ugrožavaju zdravlje, pa čak i život djeteta. TORCH infekcije se takođe ponašaju slično. Neke od njih („držanje“) primjenjuju se istovremeno na SPI, pa stoga potonje zahtijeva detaljnije razmatranje. Čitatelj će se moći upoznati s najpopularnijim tehnikama u sljedećim dijelovima članka.

Kako se pravilno pripremiti da biste dobili pouzdan rezultat?

Odmah ćemo primetiti da je priprema za PCR jednostavna, ne zahtevajući poseban napor od strane pacijenta. Potrebno je samo ispuniti tri jednostavna zadatka:

  1. Nemojte imati seksualni odnos 24 sata prije testa,
  2. Za prikupljanje i analizu krvi iz vene, morate doći na prazan stomak, uzgred, također je nemoguće piti,
  3. Ruka za urin treba noć (ujutro - u sterilnoj posudi, kupljena dan ranije u apoteci).

PCR može raditi u bilo kojem biološkom okruženju

PCR metoda nije „krvožedna“, stoga prihvaća bilo koji biološki medij koji sadrži sumnjivi infektivni agens. izbor - ono što treba uzeti za istraživanje, ostaje za doktora.

Tako, u potrazi za patogenom, pored testa krvi (iako se takođe uklapa i u većini slučajeva uzima paralelno sa drugim materijalom), možete koristiti:

  • Razmaz (izlučivanje urogenitalnog trakta),
  • Struganje sluznice usta, konjunktive, nazofarinksa, genitalnog trakta (žene uzimaju iz grlića materice i vagine, muškarci iz uretre),
  • Slina
  • Cum
  • Sok prostate,
  • Placentno tkivo i amnionska tekućina (amnionska tekućina),
  • Sediment urina (nakon centrifugiranja), na primjer, za otkrivanje nekih SPI i Mycobacterium tuberculosis,
  • Sputum i pleuralna tečnost za istu svrhu
  • Exudates
  • Cerebrospinalna tečnost u slučajevima sumnje na infektivnu leziju centralnog nervnog sistema,
  • Biopsijski materijal (biopsija), uzet iz jetre, duodenuma, želuca, itd.

Želio bih dodati gore navedenom da će materijal za testiranje u svim slučajevima, čak i u struganima i ekskrecijama, biti dovoljan, jer testiranje PCR metode ne zahtijeva velike količine, dovoljno je analiza i nekoliko mikrolitara, koji se obično uzimaju u mikroepruktu tipa Eppendorf i šalju na istraživanja.

HIV i polimeraza lančana reakcija

Obično se prilikom anonimne ankete u slučaju pozitivnih rezultata imunoblotinga dijagnoza HIV infekcije ponavlja. Ako se dijagnoza potvrdi, pacijentu se propisuju dodatne studije:

  1. Koristeći imunološke reakcije odrediti apsolutne vrijednosti broja limfocita CD4 (imunokompetentne ćelije - T-pomagači ili pomagači), koje infekcija pogađa u prvom redu, nakon čega gube svoje osnovne osobine i ne mogu razlikovati "svoje" i tuđe. " RNK virusa koji cirkuliše u krvnoj plazmi uzima se kao normalne ćelije organizma i ne reaguje na njih,
  2. Detekcija virusa RNA PCR-om i izračunavanje koncentracije virusnih čestica kako bi se utvrdila faza, težina patološkog procesa i prognoza na osnovu ovih podataka. Naravno, riječ "norma" u tom pogledu ne postoji, jer je reakcija uvijek pozitivna, a dešifriranje numeričkih vrijednosti je u nadležnosti liječnika.

PCR i hepatitis

Patogeni hepatitis C mogu se otkriti PCR-om, najčešće se test koristi za dijagnosticiranje C hepatitisa, koji se slabo detektuje drugim metodama.

Virus hepatitisa C (koji sadrži RNK) u svom ponašanju u ljudskom telu sličan je HIV-u. Zakačivši u genom ćelije jetre (hepatocite), on ostaje tamo čekajući svoj sat, koji može doći nakon 2 godine, najmanje 20 godina, pa su ga liječnici nazvali "blagim ubojicom". Hepatitis C dovodi do formiranja malignog procesa u parenhimu jetre, koji se manifestuje u kasnijim fazama. Imuni sistem ne primećuje sve ove događaje, uzimajući virus za hepatocite. Istina, proizvode se antitijela na virus u nekim količinama, ali oni ne pružaju pristojan imuni odgovor. Za dijagnozu ELISA za hepatitis C nije jako informativan, jer ukazuje na to da je virus ostavio tragove, i da li je i sam ostavio nepoznat. Kod HCV-a poznati su slučajevi samoizlječenja, dok antitijela protiv virusa ostaju i dalje cirkuliraju do kraja života (imunološka memorija). PCR značajno ispred formiranja antitela i može detektovati virusnu česticu nakon 1-1,5 tjedana, dok se antitijela mogu pojaviti u rasponu od 2 mjeseca do 6 mjeseci.

PCR dijagnostika u slučaju sumnje na prejedanje hepatitis C virusa u ljudskom organizmu je najoptimalnija metoda istraživanja, jer samo ona može prepoznati prisustvo “nežnog neprijatelja” u pacijentovoj biopsiji krvi ili jetre.

Međutim, ponekad postoje slučajevi kada je AT pozitivan, a rezultat PCR je negativan. To se ponekad dešava sa veoma malom količinom virusa ili kada je "uspavana" u jetri bez ulaska u krvotok. Da bi pronašli istinu, pacijent se ponovo analizira, ili čak više od jednog.

Infekcija humanim papiloma virusom

HPV (humani papiloma virus), ako se samo-zarastanje ne dogodi, može se, bez da se manifestuje, dugo zadržati u tijelu domaćina, što se čak i ne sumnja, jer PCR nije učinjen, a simptomi su bili odsutni. Međutim, prisutnost infekcije humanim papiloma virusom, iako latentna, daleko je od indiferentnog prema ljudskom zdravlju, gdje su određeni tipovi virusa koji uzrokuju rak posebno opasni (tipovi 16, 18).

Češće, ženska polovina populacije pati od HPV-a, jer virus voli više ženske genitalije, a posebno cerviks, gdje neki tipovi virusa doprinose razvoju displastičnih procesa, a zatim raka grlića materice, ako se ne liječi displazija i daje slobodu virusa. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

TORCH infekcije i SPI su toliko međusobno povezane da je ponekad teško odrediti kojoj grupi će se odrediti određeni patogen. Oni su generalno teško razumljivi, jer su to prilično različite grupe mikroorganizama koje se uvijek mogu prenositi spolnim putem ili samo pod određenim uvjetima (imunodeficijencija), a mogu biti od interesa samo za vrijeme trudnoće, zbog mogućeg negativnog utjecaja na njen tok i na fetus.

PCR - glavna metoda za otkrivanje skrivenih infekcija

Razvoj kliničkih manifestacija zasniva se na različitim patogenima, koji se mogu naći jedino PCR-om, koji je njegov glavni zadatak, ponekad zajedno s ELISA-om, a ponekad i ponekad. kao jedini potvrdni test, pogotovo ako su simptomi bolesti odsutni. Takva teška situacija može stvoriti polimikrobnu infekciju, koja pored otvorenih uzročnika uključuje i oportunističke patogene.

Kod muškaraca koji boluju od inflamatornih oboljenja genitalne sfere, često se otkrivaju uretritis, klamidija, ureaplazma i mikoplazma. Isti tipovi su opasni i žensko tijelo. Oni koji poznaju perfidnost hlamidije i naišli su na to sigurno će se sjetiti kako je teško pronaći i prepoznati je, stoga je analiza PCR-a o klamidiji posebno pouzdana, jer se parazit koji se skriva u ćeliji vrlo malih dimenzija ponaša oprezno i ​​uvijek šteti potajno.

Ureaplazma se često smatra paralelnom sa mikoplazmom. I to nije slučajno. Ove vrste, kao što je hlamidija, nisu niti virusi niti bakterije, žive unutar ćelija i pripadaju SPI, iako je njihovo prisustvo u zdravom organizmu daleko od neuobičajenog. Dakle, da bi se razlikovao zdrav nosač od bolesne osobe, potrebne su posebne metode u kojima se PCR smatra najpouzdanijem, jer su, zbog prirode strukture i ponašanja ovih mikroorganizama, druge studije neučinkovite.

Što se tiče herpes virusa (tip 1, 2) i citomegalovirusa, koji također pripada herpesvirusima (tip 5), situacija je također nejasna. Infekcija svjetske populacije se približava 100%, tako da je u ovom slučaju vrlo važna identifikacija virusa i njegove doze, što posebno ima ulogu u trudnoći, jer odrasla osoba koja se ukorijenila u njegovom tijelu često ne izaziva nikakve probleme i ne daje znakove bolesti.

Stoga, sličan pregled koji je propisao lekar ne bi trebalo zanemariti, jer je u nekim slučajevima lančana reakcija polimeraze neophodna i neophodna metoda laboratorijske dijagnostike koja može zaštititi ne samo ženu, već i malu, nerođenu osobu od ozbiljnih komplikacija.

U zaključku, želio bih napomenuti da je tako divna metoda, kao što je PCR, služila čovječanstvu više od 30 godina. Istovremeno, testni zadaci nisu ograničeni na potragu za infektivnim agensima. Lančana reakcija polimeraze, rođena na bazi molekularne biologije, neraskidivo je povezana s genetikom uspešno se koristi u forenzici za ličnu identifikaciju, u sudskoj medicini za uspostavljanje očinstva, u veterinarskoj medicini, ako klinika za životinje ima mogućnost da nabavi skupu opremu, kao iu drugim oblastima (industrija, poljoprivreda, itd.).

Suština metode PCR dijagnostike

PCR analiza: šta je to i kako radi? Suština metode sastoji se u upotrebi posebnog enzima DNK polimeraze in vitro za povećanje volumena određene mikrobne sredine. Da biste to uradili, pomnožite raspoloživi DNK materijal. Dakle, u prisustvu patogenog mikroorganizma u uzorku, njegova količina će se povećati zbog biokemijskih laboratorijskih manipulacija, a bakterija neće biti teško detektovati u mikroskopu.

Kako je istraživački materijal?

Za potrebnu analizu:

  • DNA matrix
  • prajmeri koji povezuju krajeve komada materijala
  • enzim otporan na toplotu DNA polimeraza,
  • hemikalije koje enzime čine ispravnim,
  • Puferski rastvor neophodan za stvaranje odgovarajućih uslova za rast i razvoj DNK materijala.

Za izvođenje PCR-a izvedite 25-30 ponavljanja, koja se sastoje od tri faze: denaturacije, žarenja i elongacije.

Za analizu polimerne lančane reakcije koristeći poseban uređaj - pojačalo. Moderna oprema omogućava instaliranje potrebnog programa grijanja i hlađenja cijevi kako bi se uklonile greške tijekom dijagnostike.

Gde se primenjuje dijagnoza?

Metoda polimerne lančane reakcije koristi se u različitim oblastima medicine:

  • kriminolozi ga koriste za identifikaciju genetskog materijala, kao što su kosa, slina ili krv,
  • PCR test krvi pomaže kod genotipizacije, na primjer, za otkrivanje individualne genetski inkorporirane reakcije na određeni lijek,
  • koristeći ovaj metod, ustanoviti postojanje srodstva među ljudima
  • Najpopularnija PCR metoda je postala u medicinskoj dijagnostici za određivanje različitih zaraznih bolesti.

Koje infekcije otkriva PCR?

Dakle, medicina je dugo i uspješno koristila analizu PCR-a. Šta je to, već smo naučili. I koji patogeni mogu biti otkriveni s njom? PCR dijagnosticira sledeće infektivne bolesti:

  • Hepatitis A, B, C,
  • ureaplasmoza,
  • kandidijaza
  • klamidija
  • mikoplazmoza
  • Gardnerellosis
  • infektivna mononukleoza,
  • trichomoniasis
  • infekcija humanim papiloma virusom
  • tuberkuloza,
  • herpes infekcije 1. i 2. vrste,
  • helikobakterioza,
  • citomegalovirus,
  • difterija,
  • salmonella, t
  • HIV infekcija.

Također, PCR metode se koriste u dijagnostici raka.

Prednosti metode

Dijagnoza PCR ima nekoliko prednosti:

  1. Visoka osjetljivost. Čak i sa samo nekoliko molekula DNK mikroorganizma, PCR analiza određuje prisustvo infekcije. Pomoći će metodu za hronične i latentne bolesti. Često, u takvim slučajevima, mikroorganizam se neobrađuje na drugi način.
  2. Bilo koji materijal je pogodan za istraživanje, na primjer, sline, krv, genitalne sekrecije, kose, stanice epitela. Najčešći je test krvi i urogenitalni razmaz na PCR.

Preporuke za pripremu za analizu

Da bi rezultati bili pouzdani prilikom provođenja PCR studije, potrebno je proći analizu, slijedeći preporuke o preliminarnoj pripremi za dijagnozu:

  1. Pre isporuke sline treba da se uzdržite od jedenja hrane i lekova 4 sata pre prikupljanja materijala. Neposredno prije zahvata isprati usta prokuhanom vodom.
  2. Gore navedena pravila treba slijediti prilikom uzimanja uzorka iz unutrašnjosti obraza. Nakon ispiranja preporučuje se lagana masaža kože kako bi se istakla tajna žlijezde.
  3. Urin se obično skuplja kod kuće. Za to je potrebno da držite pažljivo toalet genitalija. U sterilnoj plastičnoj posudi treba sakupiti 50-60 ml urina. Da bi se osigurala čistoća materijala, preporučuje se ženama da ubace tampon u vaginu, a muškarci da što više povuku kožni pregib. Materijal ne možete proći tokom menstrualnog perioda.
  4. Da biste donirali spermu morate se suzdržati od odnosa za 3 dana prije uzimanja materijala. Takođe, lekari savetuju da ne idete u saunu i da se okupate, pijete alkohol i začinite hranu. 3 sata prije analize potrebno je da se suzdržite od mokrenja.
  5. Za isporuku urogenitalnog razmaza, na primer, ako se analizira PCR hlamidija, i ženama i muškarcima se preporučuje da imaju seksualni odmor 3 dana. 2 tjedna prije analize ne mogu se uzeti antibakterijski lijekovi. Za tjedan dana morate prestati koristiti intimne gelove, masti, vaginalne čepiće, ispiranje. 3 sata prije testa, trebali biste se suzdržati od mokrenja. Tokom menstruacije, materijal se ne sakuplja, samo 3 dana nakon prestanka krvnog iscjedka može se uzeti urogenitalni razmaz.

PCR tokom trudnoće

Dok čekaju bebu, mnoge infekcije koje se prenose polnim putem su izuzetno opasne za normalan razvoj fetusa. STD mogu izazvati zaostajanje u rastu, pobačaj ili prijevremeni porod i kongenitalne malformacije djeteta. Stoga je izuzetno važno proći PCR pregled u ranoj trudnoći. Proći analizu je potrebno za registraciju - do 12 tjedana.

Materijal se uzima iz cervikalnog kanala specijalnom četkom. Postupak je bezbolan i ne predstavlja opasnost za dijete. Obično se tokom trudnoće klamidija analizira PCR metodom, kao i ureaplazmozom, mikoplazmozom, citomegalovirusom, herpesom, papiloma virusom. Takvo složeno istraživanje nazvano PCR-6.

PCR za dijagnozu HIV-a

Zbog činjenice da je lančana reakcija polimeraze vrlo osjetljiva na promjene u tijelu i na uvjete dijagnoze, mnogi faktori mogu utjecati na rezultat. Stoga, PCR analiza za HIV infekciju nije pouzdana metoda, njena efikasnost je 96–98%. U preostalih 2-4% slučajeva, test daje lažne pozitivne rezultate.

Ali u nekim situacijama nemoguće je bez PCR dijagnostike HIV-a. Obično se provodi kod osoba s lažnim negativnim rezultatom ELISA. Takvi indikatori ukazuju na to da osoba još nije razvila antitela na virus i da ih je nemoguće detektovati bez višestrukog povećanja broja. To se može postići testom krvi pomoću PCR metode.

Takva dijagnoza je neophodna i za djecu prve godine života rođenu HIV pozitivnoj majci. Metoda je jedini način da se pouzdano odredi status djeteta.

PCR za dijagnozu hepatitisa

Metoda lančane reakcije polimeraze omogućava detekciju DNK virusa hepatitisa A, B, C mnogo prije formiranja antitela na infekciju ili pojave simptoma bolesti. PCR analiza za hepatitis C je posebno efikasna, jer je u 85% slučajeva takva bolest asimptomatska i ide u hroničnu fazu bez pravovremenog liječenja.

Rano otkrivanje patogena pomoći će da se izbjegnu komplikacije i dugotrajno liječenje.

Sveobuhvatni PCR pregled

Sveobuhvatna PCR analiza: šta je to? To je lančana reakcija polimeraze, koja uključuje identifikaciju nekoliko tipova infekcija u isto vrijeme: mycoplasma genitalium, mycoplasma hominis, gardnerella vaginalis, candida, trichomonas, citomegalovirus, ureaplasma urealytikum, herpes simpleks prvog i drugog tipa, gonoreja, sifilis, papilomavirus, papilomavirus, papilomavitis, herpesitis 1. i 2. vrste, gonomija, pymplazma. Cijena takve dijagnostike kreće se od 2.000 do 3.500 rubalja. u zavisnosti od klinike, korišćeni materijali i oprema, kao i vrsta analize: kvalitativna ili kvantitativna. Šta je potrebno u vašem slučaju - doktor će odlučiti. U nekim slučajevima, dovoljno je samo odrediti prisustvo patogena, u drugima, na primjer, u slučaju HIV infekcije, važnu ulogu ima kvantitativni titar. Prilikom dijagnostikovanja svih navedenih patogena, istraživanje se naziva "PCR-12 analiza".

Dešifrovanje rezultata analize

Dekodiranje PCR analize je jednostavno. Postoje samo 2 skale indikatora - “pozitivan rezultat” i “negativan rezultat”. Kada se otkrije patogen, doktori mogu sa sigurnošću 99% potvrditi prisustvo bolesti i nastaviti liječenje pacijenta. U kvantitativnoj metodi određivanja infekcije u odgovarajućoj koloni biće prikazan numerički pokazatelj otkrivenih bakterija. Samo doktor može odrediti obim bolesti i propisati potreban tretman.

U nekim slučajevima, na primjer, kod određivanja HIV infekcije putem PCR-a, s negativnim rezultatom, potrebno je provesti dodatne preglede kako bi se potvrdili dobiveni pokazatelji.

Gdje uzeti analizu?

Gdje proći PCR analizu: u javnoj klinici ili u privatnoj laboratoriji? Nažalost, u opštinskim zdravstvenim ustanovama oprema i metode često su zastarjeli. Stoga je bolje dati prednost privatnim laboratorijama sa modernom opremom i visokokvalifikovanim kadrom. Osim toga, u privatnoj klinici ćete dobiti mnogo brže rezultate.

U Moskvi, mnoge privatne laboratorije nude PCR analizu za različite infekcije. Na primjer, u klinikama kao što su Vita, Kompleksna klinika, Srećna porodica, Uro-Pro, analiziraju PCR. Cijena istraživanja je od 200 rubalja. za određivanje jednog patogena.

Može se zaključiti da je dijagnoza infektivnih bolesti PCR-om u većini slučajeva brz i pouzdan način za otkrivanje patogena u organizmu u ranim fazama infekcije. Ipak, u nekim slučajevima vrijedi odabrati druge metode dijagnostike. Samo stručnjak može odrediti potrebu za takvom studijom. Dekodiranje PCR analize također zahtijeva profesionalni pristup. Pratite preporuke doktora i ne uzimajte sopstvene testove, koji nisu neophodni.

Prednosti PCR dijagnostike u modernoj medicini:

• Direktno otkrivanje prisustva patogena (naime, specifične regije DNK ili RNK patogena) u uzorku koji se ispituje.
• Visoka specifičnost vam omogućava da odredite jedinstvenu DNK ili RNK regiju koja je karakteristična za određeni patogen, što eliminiše mogućnost lažne reakcije.
• Visoka osjetljivost PCR metode omogućava otkrivanje čak i pojedinačnih stanica patogena (virusa, bakterija). Osjetljivost PCR analize je 10-1000 stanica u ispitivanom uzorku (na primjer, osjetljivost imunoloških i mikroskopskih testova je samo 103-105 stanica).
• Razvoj univerzalne PCR metode za otkrivanje različitih patogena. Cilj istraživanja pomoću PCR-a je genetski materijal (DNK, RNK) patogena. Ova tehnika omogućava identifikaciju nekoliko patogena iz jednog biološkog uzorka.
• Dovoljno brzo da biste dobili rezultate analize. Potpuna istraživanja se provode u 4-4,5 sati, rjeđe - malo duže.
• Mogućnost otkrivanja patogena prije početka simptoma (pretklinička dijagnoza) i nakon posljednje bolesti (retrospektivna dijagnoza). Primjer predkliničke dijagnostike će biti pregled u periodu inkubacije (od trenutka infekcije do pojave pritužbi pacijenta), kao i latentne infekcije (kada uopšte nema simptoma, već samo laboratorijski podaci - PCR, na primjer). Jedna od važnih tačaka PCR dijagnostike je PCR u arhivskom materijalu ili biološkim ostacima, što je važno za identifikaciju osobe ili očinstva.

Trenutno, PCR dijagnostika prolazi kroz značajan razvoj. Sama metoda se poboljšava, nove vrste PCR-a se pojavljuju iznova i iznova, novi testni sistemi za ovu reakciju dolaze na medicinsko tržište. Zbog toga, troškovi PCR studija svake godine postaju pristupačniji širokom krugu pacijenata.

Na čemu se zasniva PCR metoda?

Osnova lančane reakcije polimeraze je ponovljeno udvostručenje (amplifikacija) određene sekcije DNK ili RNK uz pomoć enzima u laboratoriji. Rezultat je količina DNK ili RNK dovoljna za vizualnu analizu. U toku studije, kopira se samo površina koja se uklapa u specificirane uslove, i to samo u situaciji njenog prisustva u uzorku koji se ispituje.

Na primer, materijal za studiju, koji pretpostavlja prisustvo fragmenata DNK ili RNK patogena (slina, krv, urin, iscjedak iz genitalija), nalazi se u posebnom reaktoru (pojačalo). Zatim se dodaju specifični enzimi koji se vežu za DNK ili RNK patogena, a njegova kopija se sintetiše. Ovo kopiranje se odvija u nekoliko faza tipa "lančane reakcije", i na kraju stotine i hiljade kopija može se formirati iz jedne kopije genetskog materijala. Zatim slijedi analiza i usporedba rezultata sa postojećom bazom podataka o strukturi različitih patogena. Putem PCR-a moguće je ne samo identificirati vrstu patogena, već i proizvesti kvantitativni rezultat analize, odnosno, koliko se patogena nalazi u ljudskom tijelu.

PCR metoda trenutno proširuje spektar istraživačkih mogućnosti: uvođenje mutacija, spajanje DNA fragmenata, i široko se koristi u medicini, na primjer, za uspostavljanje očinstva, pojavu novih gena, i tako dalje.

Koje se infekcije mogu otkriti uz pomoć PCR dijagnoze

1) HIV infekcija (može otkriti virus humane imunodeficijencije HIV-1)
2) virusni hepatitis A, B, C, G (RNA-HAV, DNA-HBV, RNA-HCV, RNA-HGV)
3) Infektivna mononukleoza (DNA Epstein-Barr virus-VEB)
4) Citomegalovirusna infekcija (DNA-CMV)
5) Herpes infekcija (herpes simplex DNA - HSV tip 1 i 2)
6) SPI (polno prenosive infekcije) - ureaplasmoza, gardnerellosis, klamidija, mikoplazmoza, trihomonijaza,
7) Tuberkuloza (Mycobacterium tuberculosis)
8) Onkogeni virusi - infekcija humanim papiloma virusom (humani papiloma virus (uključujući onkogene vrste 16, 18, 31, 33, 45, 51, 52, 56, 58 i 59)
9) Borrelioza, krpeljni encefalitis
10) Listerioza
11) Candida (gljive roda Candida)
12) Helicobacter pylori infekcija (Helicobacter pylori)
i drugi

Учитывая спектр возбудителей, ПЦР-диагностика активно используется в гинекологической, урологической практике, практике инфекциониста, в пульмонологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, гематологии, онкологии и других.

Материал для исследования и правила его забора

Материалом для ПЦР-исследования, в котором можно выявить чужеродную ДНК бактерии или ДНК или РНК вируса могут служить различные биологические среды и жидкости человека: слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток, тканях плаценты, крови, соке простаты, околоплодные воды, плевральная жидкость.

Ispitivanje polno prenosivih infekcija (SPI) kod muškaraca i žena uključuje izlučivanje iz genitalija, razmaz ili struganje iz grlića materice, razmaz ili struganje iz uretre (uretre), urina.

Pri ispitivanju infekcija (herpes infekcije, CMVI, mononukleoza, toksoplazmoza, hepatitis B, C, HIV infekcija), krv se sakuplja na PCR.

Za dijagnozu infektivne mononukleoze, CMV, herpesne infekcije, uzima se bris grla, a za testiranje na CMV - urin. Često, za ispitivanje lezija nervnog sistema, brojne studije prikupljaju spinalnu tečnost.

U pulmologiji je materijal sputum, pleuralna tečnost.

Prilikom ispitivanja intrauterinih infekcija - plodne tečnosti, placentnog tkiva.

Priprema za isporuku materijala i PCR dijagnostiku

Gotovo svi pacijenti koji su podvrgnuti PCR dijagnostici imaju pravo da se pouzdaju u pouzdane, tačne i brze rezultate, koji u velikoj meri zavise od kapaciteta laboratorije i profesionalnosti laboratorijskog tehničara. Istovremeno, mnogi ljudi ne misle da upravo ta pouzdanost u mnogome zavisi od nas samih, odnosno od preporuka lekara, načina života i ispravnosti uzorkovanja materijala. Kada se uzima materijal, potrebni su uslovi koji isključuju kontaminaciju (kontaminaciju) materijala i, shodno tome, dovode u pitanje objektivnost analize.

Pravilna priprema za isporuku materijala nije posebno teška. Postoje sljedeće preporuke liječnika za pacijente:

1) da nema seksualnog života dan prije isporuke materijala,
2) krv za istraživanje predaje se ujutro na prazan želudac (ne jesti, ne piti),
3) nakon isporuke urina, prvi jutarnji dio se sakuplja u čistu sterilnu posudu.

Objašnjenje rezultata PCR

Negativno PCR rezultat ukazuje da u materijalu koji se proučava u vreme isporuke nisu pronađeni tragovi infektivnih agenasa. Većina slučajeva pokazuje odsustvo infekcije, koju su pokušali da pronađu u testu.

Pozitivno PCR rezultat ukazuje na detekciju tragova infekcije u biološkom uzorku koji se ispituje. Sa velikom preciznošću, pozitivan rezultat ukazuje na prisustvo infekcije u datom trenutku.

Postoje situacije kada je PCR pozitivan, a nemoguće je govoriti o aktivnoj infekciji - to je takozvano "zdravo stanje nosioca" bez kliničkih simptoma bolesti, koje ne zahtijevaju liječenje, već zahtijeva dinamično promatranje od liječnika. Uočava se češće u brojnim virusnim infekcijama (HPV, CMVI, EBV infekcija, herpes infekcija, itd.) U materijalima kao što su pljuvačka, struganje cervikalnog kanala, uretra, odnosno iz lokalnog fokusa. Međutim, ne smijemo zaboraviti da je prijenos od nosilaca na zdrave ljude moguć, kao i prelazak na hronični oblik bolesti s procesom aktivacije. Ako je PCR pozitivan u krvi, onda to više nije stanje nosioca i zahtijeva specifičan tretman.

Kvantitativni rezultat PCR-a procjenjuje samo liječnik pojedinačno za infekciju odvojeno i nema zajedničke gradacije. Na osnovu kvantitativnog rezultata PCR-a, lekar može odrediti stepen aktivnosti infekcije i odrediti fazu bolesti, što će svakako uticati na tok i doze propisanih lijekova.

Jedno od poslednjih uzbudljivih pitanja: koliko je tačna PCR dijagnostika?

Za PCR analizu postoje 3 definicije:

1. Tačnost (sa velikom verovatnoćom mogućeg otkrivanja ili odsustva infekcije).
2. Specifičnost (tačnost detekcije specifične infekcije).
3. Osetljivost (čak i sa malim sadržajem genetskog materijala patogena u ispitivanom uzorku, infekcija će biti otkrivena).

Polimerazno-lančana reakcija gotovo da ne daje lažno pozitivne rezultate (tj. Nema pozitivnih uzoraka gdje nema infekcije). Lažno negativni rezultati se retko primećuju (češće je to povezano sa odsustvom aktivne infekcije kod osobe u ovom trenutku). Na primjer, latentna infekcija, hronična infekcija izvan aktivnosti.

Sadržaj

Početkom sedamdesetih, norveški naučnik Kjell Kleppe iz laboratorije dobitnika Nobelove nagrade Khara Gobinda Quran predložio je metodu za pojačavanje DNK pomoću para kratkih jednolančanih DNA molekula - sintetičkih prajmera [1]. Međutim, u to vrijeme ova ideja je ostala neispunjena. Lančana reakcija polimeraze (PCR) izumila je 1983. godine američki biokemičar Carey Mullis [2] [3]. Njegov cilj je bio da stvori metodu koja će omogućiti amplifikaciju DNK tokom višestrukih uzastopnih udvostručenja originalne DNK molekule pomoću enzimske DNA polimeraze. Prva publikacija o PCR metodi pojavila se u novembru 1985. godine u časopisu Science [4]. Metod je revolucionirao molekularnu biologiju i medicinu. Godine 1993. Carey Mullis je za ovo dobio Nobelovu nagradu za hemiju. [5].

Na početku upotrebe metode, nakon svakog ciklusa zagrijavanja i hlađenja, u reakcijsku smjesu je trebalo dodati DNA polimerazu, budući da je inaktivirana na visokoj temperaturi potrebnoj za odvajanje lanaca DNK heliksa. Postupak reakcije bio je relativno neefikasan, zahtijevajući mnogo vremena i enzima. Metoda lančane reakcije polimeraze je značajno poboljšana 1986. godine. Predloženo je da se koriste DNK polimeraze iz termofilnih bakterija [6]. Ovi enzimi su bili termostabilni i bili su u stanju da izdrže mnoge cikluse reakcije. Njihova upotreba je omogućila pojednostavljenje i automatizaciju PCR-a. Jedna od prvih termostabilnih DNA polimeraza izolovana je iz bakterija Thermus aquaticus and named Taq-polimeraza. Nedostatak ove polimeraze je prilično velika vjerovatnoća uvođenja pogrešnog nukleotida, jer ovaj enzim nema mehanizme za ispravljanje grešaka (3 '→ 5'-eksonukleazna aktivnost). Polimeraza Pfu i Pwo, izolovani iz arheja, imaju ovaj mehanizam, njihova upotreba značajno smanjuje broj mutacija u DNK, ali je njihova brzina (procesnost) manja od one u Taq. Sada nanesite smjesu Taq i Pfuistovremeno postići visoku brzinu sušenja i visoku preciznost kopiranja.

U vreme pronalaska metode, Carey Mullis je radio kao sintetički hemičar (sintetisao je oligonukleotide, koji su zatim korišćeni da identifikuju tačkaste mutacije hibridizacijom sa genomskom DNK) u Cetusu (Cetus Corporation), koji je patentirao PCR metodu. Cetus je 1992. godine prodao prava na metodu i patent Taq-polimeraza kompanija Hofman-La Roche za 300 miliona dolara. Međutim, ispostavilo se da Taq-polimerazu su karakterisali sovjetski biokemičari A. Kaledin, A. Slusarenko i S. Gorodetski 1980. godine [7], a 4 godine prije sovjetske publikacije, 1976. godine američki biokemičari Alice Chien, David B. Edgar i John M. Trela. [8] U tom smislu, kompanija Promega je u sudskom nalogu prisilila Rosha da se odrekne isključivih prava na ovaj enzim [9]. Američki patent za PCR istekao je u martu 2005. godine.

Metoda se zasniva na ponovljenom selektivnom kopiranju određene sekcije DNK nukleinske kiseline uz pomoć enzima u veštačkim uslovima (in vitro). Kada se to dogodi, kopira se samo područje koje zadovoljava specificirane uslove, i samo ako je prisutno u uzorku koji se ispituje. Za razliku od amplifikacije DNK u živim organizmima (replikacija), relativno kratke sekcije DNA su pojačane PCR-om. U konvencionalnom PCR procesu, dužina sekcija DNA koje treba kopirati nije veća od 3000 parova baza (3 kbp [10]). Koristeći mešavinu različitih polimeraza, uz upotrebu aditiva i pod određenim uslovima, dužina PCR fragmenta može dostići 20-40 hiljada parova baza. I dalje je značajno manja od dužine hromozomske DNA eukariotske ćelije. Na primjer, ljudski genom se sastoji od oko 3 milijarde parova baza [11].

Komponente reakcije Uredi

U najjednostavnijem slučaju, za PCR su potrebne sljedeće komponente:

  • DNA matrixsadrži DNK koju treba pojačati.
  • Dva primerakomplementarne suprotnim krajevima različitih lanaca željenog fragmenta DNA.
  • Thermostable DNA polimeraza - Enzim koji katalizira reakciju polimerizacije DNA. Polimeraza za upotrebu u PCR mora dugo ostati aktivna na visokim temperaturama, stoga se koriste enzimi izolirani iz termofila - Thermus aquaticus (Taq-polimeraza), Pyrococcus furiosus (Pfu-polimeraza), Pyrococcus woesei (Pwo-polimeraza), Thermus thermophilus (Tthpolimeraza) i druge.
  • Deoksiribonukleozid trifosfati (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Mg 2+ ioni potrebni za rad polimeraze.
  • Buffer solutionobezbeđivanje neophodnih uslova reakcije - pH, jonska snaga rastvora. Sadrži sol, albumin goveđeg seruma.

Kako bi se izbjeglo isparavanje reakcijske smjese, u epruvetu se dodaje ulje visokog vrelišta, na primjer, vazelinsko ulje. Ako se koristi poklopac za grijanje, to nije potrebno.

Dodavanje pirofosfataze može povećati prinos PCR reakcije. Ovaj enzim katalizira hidrolizu pirofosfata, nusproizvoda dodavanja nukleotidnih trifosfata u rastući lanac DNA, u ortofosfat. Pirofosfat može inhibirati PCR reakciju [12].

Primers Edit

Specifičnost PCR se zasniva na formiranju komplementarnih kompleksa između matrice i prajmera, kratkih sintetičkih oligonukleotida dužine od 18-30 baza. Svaki od primera je komplementaran jednom od lanaca dvolančane matrice i ograničava početak i kraj pojačanog regiona.

Nakon hibridizacije matrice sa prajmerom (žarenje [13]), potonji služi kao prajmer za DNK polimerazu tokom sinteze komplementarnog lanca matrice (vidi dole).

Najvažnija karakteristika prajmera je tačka topljenja (Tma) kompleksna matrica početnika.

Tm - temperatura na kojoj polovina DNK obrasca formira kompleks sa oligonukleotidnim prajmerom. Usrednjena formula brojanja Tm za kratki oligonukleotid (i za duge fragmente DNA), uzimajući u obzir koncentraciju K + i jona DMSO:

gde je L broj nukleotida u prajmeru, K + je molarna koncentracija kalijumovih jona, G + C je suma svih gvanina i citozina.

U slučaju pogrešnog izbora dužine i nukleotidne kompozicije prajmera ili temperature žarenja, moguće je formiranje djelomično komplementarnih kompleksa s drugim regijama DNK uzorka, što može dovesti do pojave nespecifičnih proizvoda. Gornja granica tačke topljenja ograničena je optimalnom temperaturom polimeraze čija aktivnost pada na temperaturama iznad 80 ° C.

Prilikom odabira primera, poželjno je pridržavati se sljedećih kriterija:

40—60 %,

  • close tm prajmeri (razlike ne više od 5 ° C),
  • odsustvo nespecifičnih sekundarnih struktura - ukosnica [15] i dimera [16],
  • Poželjno je da gvanin ili citozin budu prisutni na 3'-kraju, jer oni formiraju tri vodikove veze sa molekulom matriksa, što hibridizaciju čini stabilnijom.
  • Amplifier Edit

    PCR se izvodi u termalni cikler - uređaj koji omogućava periodično hlađenje i zagrijavanje cijevi, obično s točnošću od najmanje 0,1 ° C. Moderna pojačala omogućuju vam postavljanje složenih programa, uključujući mogućnost "vrućeg starta", Touchdown PCR (vidi dolje) i naknadno pohranjivanje amplificiranih molekula na 4 ° C. Za PCR u realnom vremenu proizvode se instrumenti opremljeni fluorescentnim detektorom. Tu su i uređaji s automatskim poklopcem i odjeljkom za mikroploče, koji im omogućuje da budu ugrađeni u automatizirane sustave.

    Obično se tokom PCR-a izvodi 20-35 ciklusa, od kojih se svaki sastoji od tri faze (slika 2).

    Denaturation Edit

    Dvodelni DNK uzorak se zagreva na 94–96 ° C (ili do 98 ° C, ako se koristi posebno stabilna termostabilna polimeraza) 0,5-2 min, tako da se DNK lanci razdvoje. Ova faza se naziva topljenje (denaturacija)jer su uništene vodikove veze između dva lanca DNK. Obično, prije prvog ciklusa, dugo zagrijavanje reakcijske smjese se provodi tijekom 2-5 minuta kako bi se u potpunosti uklonio šablon i prajmeri.

    Annealing Edit

    Kada se lanci razdvoje, temperatura se spušta tako da se prajmeri mogu vezati za jednolančanu matricu. Ova faza se zove žarenje. Temperatura žarenja zavisi od sastava prajmera i obično se bira 5 stepeni niže od tačke topljenja prajmera. Pogrešan izbor temperature žarenja dovodi ili do slabog vezivanja prajmera za matricu (na povišenoj temperaturi), ili do vezivanja na pogrešnom mestu i pojave nespecifičnih proizvoda (na niskoj temperaturi). Vrijeme faze žarenja je 30 sekundi, a za to vrijeme polimeraza već ima vremena da sintetizira nekoliko stotina nukleotida. Zbog toga se preporučuje da se odaberu prajmeri sa tačkom topljenja iznad 60 ° C i istovremeno izvrše žarenje i izduženje na 60-72 ° C.

    Elongation Edit

    DNK polimeraza replicira šablonu šablona koristeći prajmer kao seme. Ovo je pozornica izduženje. Polimeraza započinje sintezu drugog lanca od 3'-kraja prajmera koji je povezan sa matricom i kreće se duž matrice, sintetizirajući novi lanac u smjeru od 5'- do 3'-kraja. Temperatura istezanja zavisi od polimeraze. Često korištene polimeraze Taq i Pfu najaktivniji na 72 ° C. Vreme izduženja zavisi i od tipa DNK polimeraze i od dužine amplificiranog fragmenta. Obično je vrijeme izduženja jednako jednom minutu za svakih tisuću parova baza. Nakon završetka svih ciklusa, često se izvodi dodatna faza. final elongationzavršiti sve fragmente jednog lanca. Ova faza traje 7-10 minuta.

    Količina specifičnog proizvoda reakcije (ograničena prajmerima) teoretski se povećava proporcionalno 2 n - 2n, pri čemu je n broj reakcijskih ciklusa [17]. U stvari, efikasnost svakog ciklusa može biti manja od 100%, tako da u stvarnosti P

    (1 + E) n, gdje je P količina proizvoda, E je prosječna efikasnost ciklusa.

    Broj "dugih" kopija DNK takođe raste, ali linearno, tako da specifični fragment dominira u proizvodima reakcije.

    Rast traženog proizvoda u geometrijskoj progresiji ograničen je količinom reagensa, prisustvom inhibitora, formiranjem nusproizvoda. U poslednjim ciklusima reakcije, rast se usporava, što se naziva "efekt platoa".

    • RPA (Engl. Recombinase Polymerase Amplification - Rekombinaza polimeraza amplifikacija) - koristi se gdje je potrebno pojačanje DNA / RNA 15 minuta bez termičkog ciklera (izotermna reakcija) [18] [19]
    • Nested PCR (Nested PCR (Eng.)) - koristi se za smanjenje broja nusprodukata reakcije. Koriste se dva para prajmera i izvode se dvije uzastopne reakcije. Drugi par prajmera pojačava region DNK unutar proizvoda prve reakcije.
    • Obrnuti PCR (Inverzni PCR (eng.)) - koristi se ako je poznat samo mali dio unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je potrebno odrediti susjedne sekvence nakon unošenja DNA u genom. Za implementaciju obrnutog PCR-a izvršena je serija rezanja DNK sa restriklizama, nakon čega slijedi povezivanje fragmenata (ligacija). Kao rezultat, poznati fragmenti se pojavljuju na oba kraja nepoznatog područja, nakon čega se PCR može obaviti kao i obično.
    • PCR sa reverznom transkripcijom (Reverzna transkripcija PCR, RT-PCR (engleski)) - koristi se za amplifikaciju, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz RNK biblioteke. Prije konvencionalne PCR, sintetizira se jednolančana DNA molekula na mRNA šablonu pomoću revertaze i dobiva se jednolančana cDNA, koja se koristi kao šablon za PCR. Ova metoda često određuje gdje i kada su ti geni izraženi.
    • Asimetrična PCR (Engleski asimetrični PCR) - provodi se kada je potrebno pojačati uglavnom jedan od lanaca originalne DNA. Koristi se u nekim analizama sekvenciranja i hibridizacije. PCR se izvodi kao i obično, osim što se jedan od prajmera uzima u velikom suvišku. Modifikacije ovog metoda je engleski.Linear-After-Ton-Exponential-PCR (LATE-PCR), koji koristi prajmere sa različitim koncentracijama, i prajmer niske koncentracije je izabran sa višom (tačka topljenja) od prajmera visoke koncentracije. PCR se izvodi na visokoj temperaturi žarenja, tako da je moguće održati efikasnost reakcije kroz sve cikluse [20].
    • Kvantitativna PCR (Kvantitativni PCR, Q-PCR (engleski)) ili PCR u realnom vremenu - koristi se za direktno posmatranje mjerenja količine specifičnog PCR proizvoda u svakom reakcijskom ciklusu. Ova metoda koristi fluorescentno obilježene početnike ili DNK sonde za precizno mjerenje količine proizvoda reakcije dok se akumulira, ili se koristi fluorescentna interkalacijska boja. Sybr zelena i (ali bolje koristiti SYTO 13), koji se veže za dvolančanu DNA. Sybr zelena i pruža jednostavnu i ekonomičnu opciju za detekciju i kvantifikaciju PCR proizvoda u realnom vremenu PCR-a bez potrebe za specifičnim fluorescentnim sondama ili prajmerima. Tokom pojačavanja boje SYBR Green I ubacuje se u manji žlijeb DNA PCR produkata i emitira fluorescentni signal, jači od nevezanog bojila, kada se ozračuje plavim laserom. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный) [21] .
    • Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR (англ.) ) — с помощью этого подхода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров. Prvi ciklusi se izvode na temperaturi iznad optimalne temperature žarenja, zatim se svakih nekoliko ciklusa temperatura žarenja postepeno smanjuje do optimalne. To je učinjeno kako bi se osiguralo da se prajmer hibridizira sa komplementarnim lancem duž cijele dužine, dok na optimalnoj temperaturi žarenja, prajmer djelomično hibridizira s komplementarnim lancem. Parcijalna hibridizacija prajmera na genomskoj DNK dovodi do nespecifičnog amplifikacije, ako postoji dosta veznih mjesta za prajmer. U većini slučajeva, prvih deset ciklusa PCR-a može se provesti na temperaturi žarenja od 72-75 ° C, a zatim odmah smanjiti na optimalnu, na primjer, na 60-65 ° C.
    • Metoda molekularne kolonije (PCR u gelu, engleska kolonija - PCR kolonija) - polimerizacija akrilamidnog gela sa svim komponentama PCR na površini i izvršiti PCR. U tačkama koje sadrže analiziranu DNK, dolazi do pojačavanja sa formiranjem molekularnih kolonija.
    • PCR sa brzom amplifikacijom cDNA završava (rođen Rapid amplifikacija cDNA krajeva, RACE-PCR).
    • PCR dugih fragmenata (eng. Long-range PCR) - modifikacija PCR za amplifikaciju proširenih regiona DNA (10 hiljada ili više baza). Koristiti mješavinu dvije polimeraze, od kojih je jedna - Taq-polimeraza sa visokom procesnom sposobnošću (koja je sposobna sintetizirati dugi lanac DNK u jednom prolazu), a druga je DNA polimeraza sa 3'-5'-egzonukleaznom aktivnošću, obično polimeraza Pfu. Druga polimeraza je neophodna da bi se ispravile greške koje su prvo uvedene, jer Taq-polimeraza zaustavlja sintezu DNK ako se doda ne-komplementarni nukleotid. Ovaj ne-komplementarni nukleotid uklanja Pfu polimerazu. Mešavina polimeraza se uzima u odnosu 50: 1 ili čak manje od 100: 1, gde Taq-polimeraza se uzima 25-100 puta više nego Pfupolimeri.
    • Rapd (Eng. Random Amplification of Polymorphic DNA), PCR sa nasumičnom amplifikacijom polimorfne DNK - koristi se kada je potrebno razlikovati organizme slične genetičkom sekvencom, na primjer, različite vrste kultiviranih biljaka, pasmine pasa ili blisko srodnih mikroorganizama. U ovoj metodi se obično koristi jedan mali prajmer (oko 10 bp). Ovaj primer će biti delimično komplementaran nasumičnim regionima DNK ispitivanih organizama. Odabirom uslova (dužina primera, sastav, temperatura, itd.) Moguće je postići zadovoljavajuću razliku u PCR uzorku za dva organizma.
    • PCR specifičan za grupu (PCR specifičan za grupu) - PCR za srodne sekvence unutar jedne ili između različitih vrsta pomoću konzervativnih prajmera za ove sekvence. Na primjer, odabir univerzalnih prajmera za ribosomske gene 18s i 26s za amplifikaciju sekvence genske sekvence specifične za vrstu 18s i 26s konzervativan među vrstama, stoga će se PCR između ovih gena izvoditi za sve ispitivane vrste. Suprotno od ove metode je jedinstveni PCR (eng. jedinstveni PCR), gdje je zadatak odabrati početnike za pojačavanje samo jedne sekvence svih povezanih.
    • PCR pomoću vrućeg starta (English Hot-start PCR) - modifikacija PCR-a pomoću DNA polimeraze, u kojoj je aktivnost polimeraze blokirana na sobnoj temperaturi sa antitijelima ili malim molekulima tipa Affibody koji imitiraju antitijela, to jest, u trenutku postavljanja reakcije prije prve denaturacije u PCR. Tipično, prva denaturacija se vrši na 95 ° C tokom 10 minuta.
    • Virtual PCR (eng. in silico PCR, digitalni PCR, elektronski PCR, e-PCR) je matematička metoda računalne analize teorijske polimerazne lančane reakcije koristeći listu sekvenci primera (ili DNA probe) za predviđanje potencijalne amplifikacije DNK genoma, kromosoma, kružne DNK ili bilo koji drugi komad DNK.

    Ako je nukleotidna sekvenca šablona delimično ili nepoznata, možete koristiti degenerirani prajmeričija sekvenca sadrži degenerirane položaje u kojima se mogu nalaziti sve baze. Na primer, sekvenca prajmera može biti: ... ATH ...gdje je H A, T ili C. t

    PCR se koristi u mnogim oblastima za analizu i naučne eksperimente.

    Forensics Edit

    PCR se koristi za poređenje takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban je uzorak genetskog materijala sa mjesta zločina - krvi, pljuvačke, sjemena, kose, itd., Koji se uspoređuje s genetskim materijalom osumnjičenog. Vrlo mala količina DNK je dovoljna, teoretski, jedna kopija. DNA se cijepa na fragmente, a zatim pojačava PCR-om. Fragmenti se razdvajaju elektroforezom u DNK. Dobija se uzorak rasporeda DNK traka genetski otisak prsta (eng. genetic fingerprint).

    Uredi medicinsku dijagnostiku

    PCR omogućava značajno ubrzavanje i olakšavanje dijagnoze nasljednih i virusnih bolesti. Željeni gen se umnožava pomoću PCR-a pomoću odgovarajućih prajmera, a zatim sekvencionira da bi se odredile mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma bolesti.

    Personalizirana medicina Edit

    Ponekad su lekovi toksični ili alergični za neke pacijente. Razlozi za to su dijelom u individualnim razlikama u osjetljivosti i metabolizmu lijekova i njihovih derivata. Ove razlike se određuju na genetskom nivou. Na primer, kod jednog pacijenta određeni citokrom (protein jetre, odgovoran za metabolizam stranih supstanci) može biti aktivniji, u drugom - manje. Kako bi se odredilo koji tip citokroma ima ovaj pacijent, predlaže se da se provede PCR analiza prije upotrebe lijeka. [ T izvor nije naveden 3300 dana ] Takva analiza se naziva preliminarna genotipizacija (engleska prospektivna genotipizacija).

    Kloniranje gena Edit

    Kloniranje gena (ne smije se miješati s kloniranjem organizama) je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacije genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine proizvoda određenog gena. PCR se koristi za amplifikaciju gena, koji se zatim ubacuje u vektor - fragment DNK koji nosi vanzemaljski gen u istom ili drugom, pogodnom za uzgoj, organizam. Kao vektori, na primer, koriste se plazmidi ili virusna DNK. Umetanje gena u strani organizam se obično koristi za dobijanje proizvoda ovog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Dakle, u industrijskim količinama, mnogi proteini se dobijaju za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

    Sekvenciranje DNK Uredi

    U metodi sekvenciranja pomoću fluorescentno obeleženog ili radioaktivnog izotopa dideoksinukleotida, PCR je integralni deo, jer se tokom polimerizacije u DNK lanac ubacuju nukleotidi obeleženi fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom. Dodavanje dideoksinukleotida u sintetizovani lanac dovodi do prekida sinteze, što omogućava da se odredi položaj specifičnih nukleotida nakon razdvajanja u gelu.

    Pogledajte video: Lančana reakcija 2013. Klasična gimnazija, Zagreb (Jun 2019).

    Loading...